小普课堂 做好抗体标记，这4种措施你都用对了吗？

随着蛋白组学的深化研讨，抗体标记技术也被普遍用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等范畴，但很多科研人员在选择多种标记的抗体时遇到艰难，那么今天我们一同了解这四种常用的抗体标记措施，这些措施平常都用对了吗？

什么是抗体标记？

抗体标记是指将标记物（酶，荧光素，生物素等）共价衔接到抗体上，与待检测物（如某些特定抗原）特异性反响构成多元复合物，并借助于仪器对实验结果直接镜检察看或中止自动化测定，以用于对立原、抗体反响中止定性和定位研讨或中止定性和定量测定。

荧光色素标记抗体

这种标记措施是将荧光素与相应的抗体(或抗原)分离，将荧光标记的抗体(或抗原)与标本中相应的抗原构成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜察看。在显微镜若存在荧光则意味着存在抗原抗体复合物，因而可依据已知的抗体(或抗原)推断出另一种未知抗原(或抗体)的存在。

操作步骤

1. 用于分别标记抗体和游离的荧光色素准备好凝胶滤柱。运用消弭分别球形蛋白的极限 20 000 ～ 50 000 凝胶介质和细粒凝胶(直径约 50 um）。所需凝胶滤柱的尺寸可依据偶联反响的总体积中止× 20 来肯定。按厂家阐明准备滤柱，用 20 双柱床体积 PBS 注入滤柱，直到缓冲液水平刚刚降低到柱床顶部，关闭滤纸底部的阀门或运用塑料粘土(或 parafilm ）封锁底部，使滤柱不再活动。
2. 用0.1mol/L 硼酸钠或碳酸钠的制备浓度至少为 2mg/ml 的抗体溶液（pH9.0）。含一级胺的外来分子应避免引入。
3. 用无水DMSO 溶解(优级纯) FITC或TRITC至1mg/ml。每次标记反响时需即时配置。
4. 每 1ml 蛋白溶液加50ul染液，每次都要5ul 慢慢参与，参与时应悄然连续搅拌。
5. 置4℃避光反响1h 。
6. 加氯化铵至50mmol/L，室温孵育2h。参与0.1 %二甲苯氰和5％甘油。
7. 经过凝胶过滤分别分离物与未分离的染料。当心肠将偶联反响产物加在滤柱顶部，翻开阀门使抗体溶液流过滤柱直至刚好进入柱床。再当心肠将 PBS 加在滤柱顶部并与缓冲液供给装置衔接。分离染料的抗体首先洗脱，通常可在室光下见到。
8. 将洗脱液的分离物4℃贮存于避光容器，必要时参与 0.02％叠氮钠。
9. 中止荧光素偶联反响时，应经过丈量495nm和280nm 波长的吸光值计算荧光素和蛋白的比率，罗丹明的丈量波长在 550nm 和 280nm 。荧光素的吸光值比例（ 496nm/280nm ）应在 0.3 ～ 1.0 之间，罗丹明的吸光值比率（ 550nm/280nm ）在 0.3 ～ 0.7 之间。低于上述比率将招致低信号，高比率则呈现高背景。若比率太低，应运用低浓度抗体与高浓度染料重复分离；若比率太高，则可恰当调整后重新标记，或经过 DEAE 离子交流层析柱进一步纯化抗体。用 10mmol/L 磷酸钾（ pH8.0 ）均衡并灌注滤柱，经过增加盐浓度中止梯度洗脱。丈量每一组分的吸光值比率（ 495/280 或 550/280 ），选取恰当组分兼并。

生物素标记抗体

抗体标记中生物素的引入使整个过程灵活度大大进步！这种措施可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基与酰化的生物素共价分离，生物素化的分子能够经过酶标记的抗生物素蛋白或荧光染料-链霉抗生物素蛋白复合物来检测。小分子水溶性生物素对链霉亲和素的高亲和力是该措施的设计基础。

操作步骤

1. 用无水 DMSO 配制 10mg/ml 生物素 N- 羟基琥珀酰亚胺酯溶液。
2. 硼酸盐缓冲液（0.1mol/L, pH8.8 ）配制浓度至少为1 ～3mg/ml 假如在抗体贮存过程中添加叠氮钠，则必须在硼酸盐缓冲液中充沛透析去除叠氮钠。
3. 按25～100μg/mg将生物素酯参与抗体，在室温下平均混合孵化4h。在完成组合反响之前DMSO最终浓度不得低于5 %，否则生物素酯会沉淀。高浓度的生物素酯会招致体上分离多个生物素分子，因而一切抗体都可能被标记。较低的比例将使生物素化坚持在最低限度（25μg生物素酯/mg摩尔比最初是抗体10:1）。
4. 每250μg添加生物素酯20μl1mol/L氯化铵，室温孵化10min 。
5. 运用抗体溶液PBS 或其他缓冲液透析，以去除未分离的生物素。由于生物素分子较大，透析比预期的要慢，或运用蛋白质A或蛋白G层析柱再次纯化抗体。
6. 标记抗体按纯化抗体的贮存措施保存。

放射性碘标记抗体

蛋白质的碘标记措施有很多种，好比我们常用的化学法或酶促法经过氧化对蛋白质分子中止碘化等。

操作步骤

1. 在碘标记前，准备氯甘脲包试管（2支6mm碱性玻璃管或1.5ml锥形试管)。氯甘脲溶于浓度0.5μg/ml的氯仿中。然后将其分别参与试管管100μl和20μl。让氯仿在通风柜中挥发过夜。在单调器中贮存室温试管，可保存数年。包被有20μl氯甘脲试管碘化效率低。假如抗体在正常碘化反响中受损，能够运用。
2. 准备分别标记抗体的凝胶层剖析柱，体的凝胶层剖析柱。排阻限制为20000～50000凝胶介质用于分别球形蛋白分子。选择中等粒度的凝胶微柱(直径约100μm）。按阐明书准备配备1ml标记后，体积凝胶微柱的滤柱将被丢弃，因而应选择适合的滤柱。为了最大限度地减少碘化蛋白的非特异性组合，滤纸应至少先运用10倍体积的含0.02％叠氮钠的1％BSA/PBS然后再用10倍体积的PBS去除淋洗滤柱BSA。或者用含BSA运用前冲洗缓冲液收缩凝胶颗粒BSA。让滤柱内的缓冲液流出，直到刚好低于柱床顶部，关闭凝胶柱底部的阀门，或用塑料粘土梗塞胶柱末端。
3. 碘化反响前应立刻准备终止管，用于终止氧化反响，保存未参与分离反响的剩余碘。1.5ml参与锥形试管50μl氯甘脲终止缓冲液
4. 室温下，在通风柜内参与氯甘脲袋50μl抗体0.5mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）配制，浓度为0.2～1mg/ml。
5. 添加抗体氯甘脲试管500μCiNa，把吸液头扔进去放弃125I容器中的资料2min，时间能够稍微延长，但可能会增加抗体的氧化损伤。
6. 用巴斯德移液管移动试管中的液体50μl悄然混合氯甘脲终止缓冲液的试管。将巴斯德移液管和氯甘脲包放入放射性废物容器中。
7. 当心将终止管中的反响混合物添加到滤柱中，并将移液管丢入放射性废物容器中。
8. 放开滤柱阀门，开端搜集洗脱液1.5ml锥形试管。碘标记蛋白流入凝胶微珠后，当心添加到滤柱中0.3ml含0.02％叠氮钠PBS。在第一管中继续搜集洗脱液。当缓冲液抵达凝胶微珠顶部时，用第二个锥形试管交流，然后参与滤柱0.3ml含0.02％叠氮钠的PBS，再搜集洗脱液。继续重复上述洗脱步骤。微型检测仪用于监测各种管道125I标记抗体和游离标记物的峰值。抗体应出往常第一位2～4洗脱成分明显早于蓝色二甲苯蓝氰醇，后者与游离标记物一同洗脱。
9. 兼并含碘化抗体的洗脱组分。将未参与反响的标记物和整个过滤柱与放射性废物容器一同丧失。
10. 可贮存标记抗体1％PBS/BSA放入洗脱缓冲液中4℃保存。抗体固然稳定，但放射性碘不稳定。因而，应标记抗体6周内运用。

生物合成法标记单克隆抗体

操作步骤

1. 杂交瘤细胞在标记时必须生长旺盛，快速增殖。离心（3000 转/10min）搜集大约2×106个细胞。
2. 用37℃不含蛋氨酸的培育基重悬细胞，洗一次，然后离心300g，10min。
3. 不含蛋氨酸的培育基重悬细胞至约106/ml。参与[35S]蛋氨酸(每次标记100μCi）可取得的放射性强度约为105～106cpm的抗体。
4. 于CO2培育箱中37℃孵育过夜。
5. 悬液细胞1000g离心10min，取得密集的细胞沉淀。放弃上清液。1/20体积的1mol/LTris(pH8.0)和叠氮钠至0.02％。

关于普健

普健生物（AtaGenix）于2012年在武汉成立，作为武汉国度生物产业基地公共效劳平台—光谷抗体发现与选择公共效劳平台。普健生物（AtaGenix）专注于重组蛋白、抗体、诊断原料、抗体药物发现等自主技术平台的树立和下游生物医药产品的战略协作。经过10年的展开，普健生物已成为一家立足武汉，业务掩盖全国、辐射全球的高新技术效劳企业。目前公司具有4200平米自建实验室（包含800平高规范BSL-2级细胞房），具有齐全蛋白抗体开发设备500余套，包含高通量蛋白纯化仪、Agilent 流式细胞剖析仪，全自动HPLC剖析仪，openSPR蛋白、抗体亲和力测定仪，Olympus荧光显微镜， BTX电融合仪，2*7L微生物发酵罐，中试型高压均质机，全自动管式化学发光仪，以及配套的高速离心机，细胞计数仪及大容量细胞培育摇床。公司先后取得荣誉：3551人才计划、高新技术企业、技术先进型效劳企业、光谷瞪羚企业。

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