数字PCR在肿瘤基因突变检测中的应用

本文原载于中华检验医学杂志, 2016,39(03)

随着分子生物学技术的展开和提高，核酸的剖析检测已取得了严重停顿。现今一些癌症复杂的遗传背景曾经被基本阐明[]，这些遗传学变异包含基因的片段缺失、点突变、染色体重组、染色体片段增加或表观遗传变更等。由于这些变更只在肿瘤细胞中呈现，因而能够作为特定的肿瘤标记物，其可被分为3大类别：(1)诊断性标记物，可反响疾病病灶部位和相应阶段，(2)预后标记物，可反响肿瘤展开和复发的可能性，(3)预测性标记物，可用于预知对治疗计划的反响效果，药效动力学和毒副反响[]。由于以上这些标记物能够从分子水平上反映肿瘤的状况，因而其在临床的应用有利于个体化医疗和精准医疗的展开。而精确检测肿瘤分子标记物则必须求一种无论面对什么样的生物样本(例如肿瘤组织、血、尿、粪便等)，都具有高灵活性和精准性检测才干的技术。

现今临床上辨认和定量DNA、RNA的改动，通常采用PCR措施，这是基因检测的基本措施，但其有一定的局限性。例如，运用传统PCR技术检测来源于生物样本的复杂DNA混合物中的稀有变异拷贝时，只能得到一种平均信号，这种整体剖析的技术其灵活度较低。

近年来dPCR的展开使得高灵活度和高精确度定量检测稀有变异序列成为可能。dPCR在剖析复杂的生物样本上有很多的优势，除了相较于qPCR具有高灵活度的定量检测才干外，还能够避免生物样本中存在的多种抑止剂的干扰和进步各实验室之间的检测可比性(得益于数据的高度重复性)。dPCR从有限稀释PCR展开到今天的微滴dPCR，阅历了几代的技术改造，能够把样品从有限地分配成几十份到往常分散到几万份(如Bio－Rad公司的QX－100)，以至上千万的微滴中(RainDance Technologies公司的RainDrop)，构成单一分子反响，用于基因标记物的检测，特别适用于癌症的相关研讨。

一、dPCR：已知肿瘤基因变异的检测应用

(一)dPCR在肿瘤治疗监测中的应用

具有高灵活度和定量检测才干的皮升微滴dPCR已被用于晚期结直肠癌患者临床相关KRAS突变基因的检测。Laurent－Puig等[]在一项触及177例转移性结直肠癌患者的研讨中，关于低频KRAS突变基因存在的临床意义中止了深化的讨论。发现KRAS等位基因突变率与抗EGFR疗法敏理性呈反向线性关系，且高等位基因突变率会惹起无停顿生存期(Progression Free Survival，PFS)和总生存率(Overall Survival，OS)的恶化和降低。该研讨表明KRAS突变率，可作为预测抗EGFR疗法疗效的生物指标。

运用EGFR酪氨酸激酶抑止剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)治疗非小细胞肺癌可增加患者生存率。携带突变型EGFR的患者最初会对TKI疗法极为敏感，但是他们中的大多数在经过一段时间的治疗(抗癌药物：吉非替尼Gefitinib或厄洛替尼Erlotinib)后会产生继发性耐药。继发性耐药与EGFR T790M变异(耐药率约50%)和MET癌基因扩增(耐药率约15%)相关。最近有研讨显现，MET基因扩增其实早在治疗开端前就存在于肿瘤中的少数亚克隆中(在细胞系中<0.1%，在未接受治疗的肺癌细胞中<1%)。运用灵活度较低的常规措施检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤T790M变异，采用高灵活度法(如dPCR)检测则能够发现较高比例的携带突变型患者[]。

在一项研讨中，作者运用靶向测序和皮升微滴dPCR技术对11例卵巢低级别浆液性瘤(low grade serous carcinomas，LGSC)患者的瘤内异质性中止了时间和空间剖析[]，发往常多数患者中都可检测到的变异，出往常某一患者中时会在即便没有接受任何治疗的状况下，影响疾病进程(如KRAS或BRAF突变)。这少数LGSC中的异质性能否是一种普遍现象，还需求更多的研讨确认，这将改动肿瘤突变阶段剖析中的取样方式，从而影响治疗计划的选择和决议。

(二)dPCR在定量检测肿瘤患者体液中循环DNA的应用

循环核酸存在于人体体液中，包含血液、尿液、粪便、唾液和滑膜液等。健康人的游离DNA (cell－free DNA，cfDNA)含量大约为0～100 ng/ml，肿瘤患者为0～5 000 ng/ml。游离DNA长度普通为150～200 bp，普通来自于细胞凋亡或细胞坏死、溶解或细胞碎片。

监测肿瘤患者血液中的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)具有重要的临床意义。事实上，无创(或微创)监测ctDNA不时以来都是肿瘤学研讨中的庞大应战。动态监测这种循环基因标记能够跟踪肿瘤演化，以肯定有效的治疗计划或发现潜在的复发倾向。

来源于肿瘤细胞的DNA常常很大水平上被非肿瘤细胞死亡后释放的DNA稀释，在肿瘤早期阶段，ctDNA仅占总游离DNA的0.01%。因而，ctDNA的检测就需求一种比常规措施(如qPCR和测序)更灵活更特异的技术。如上所述，dPCR特别合适检测以及定量微量分子标记，如包含ctDNA在内的稀有突变。最近已有研讨运用多重皮升微滴dPCR检测转移性结直肠癌患者血浆游离DNA中的KRAS突变。该研讨显现总的原癌组织和血浆样本剖析分歧性为92%[]。

dPCR也已被应用于黑色素瘤患者血浆中等位基因突变检测[,]。最近Chang－Hao等[]经过dPCR来监测黑色素瘤患者的治疗反响状况，他们检测了6例Ⅳ期黑色素瘤患者治疗期间的ctDNA水平。固然这些患者的治疗措施不同，但他们的ctDNA水平(每ml血浆中突变等位基因的拷贝数)表示分歧且所表白的信息量比乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenease，LDH)更丰厚(LDH是评价这类癌症疾病进程的常用指标)。在最近的另一项研讨中，Sanmamed等[]经过dPCR对运用BRAF抑止剂治疗的皮肤黑色素瘤患者ctDNA中BRAF V600E突变型中止了检测，发现肿瘤组织检测结果与血浆检测结果分歧性为84.3%。

固然迄今为止大部分已发表的研讨都集中于转移癌的ctDNA的检测，由于癌症晚期时ctDNA在总游离DNA中占比较高，但dPCR很可能完成部分肿瘤ctDNA的监测。这样的监测惹起了肿瘤学研讨者的高度关注，有助于治疗管理和跟踪早期癌症患者病情停顿。Beaver等[]最近展开了一项研讨，应用皮升微滴dPCR来检测早期乳腺癌患者血浆中的ctDNA。作者剖析了29例乳腺癌患者的肿瘤组织以及手术前后血浆样本中PI3KCA的突变状况。应用Sanger测序和皮升微滴dPCR靶向检测肿瘤组织中PI3KCA的特定变异，并同时筛查其相应血浆样本。有趣的是，dPCR确认了Sanger测序发现的一切变异，同时还发现另外5个额外突变。Olsson等[]展开了一项20例原发性乳腺癌患者的回想性研讨，他们连续监测了这些患者在癌转移早期时的ctDNA水平，并中止了长期随访。在对原发性肿瘤中止全外显子测序后，再运用dPCR定量检测肿瘤特异性重组变异，证明ctDNA监测可作为肿瘤复发的相关检测。与现有的临床检测相比，ctDNA检测作为复发察看指标可平均提早11个月。

Janku等[]运用1皮升体积大小的微滴dPCR对6例脂质肉芽肿病(Erdheim－Chester disease，ECD)患者血浆和尿液中的游离DNA中止了剖析，在3例患者的血浆和尿液中同时检测出BRAF V600E突变，2例分别只在血浆或者尿液中检测到了BRAF V600E突变基因，只需1例患者的血浆和尿液检测中都未见BRAF基因突变。Hyman等[]经过dPCR靶向检测朗格汉斯组织细胞增生症(Langerhans cell histiocytosis，LCH)或ECD患者血浆和尿液游离DNA中的BRAF V600E突变(n＝30)，研讨显现组织检测结果与尿液中游离DNA基因型完整分歧。以上研讨表明患者血浆或尿液中的循环DNA能够替代组织DNA作为患者肿瘤基因突变的判别指标。

dPCR的定量才干和精确度使其还能够作为精确测定DNA绝对值的一种技术。这些特征可应用于基因拷贝数的计算或者转录本的定量剖析(包含mRNA、miRNA和长链非编码RNA等)。癌症患者循环miRNA表白改动的报道已屡见不鲜，且其极有希望成为癌症分类的组织标记。即便在癌症早期，血浆或血清中肿瘤来源的miRNA也可作为癌症检测的分子标记。miRNA十分稳定且获取方便，使其具有极大的潜力成为理想的肿瘤标记物。最近dPCR已被应用于miRNA表白变更的检测，以评价循环miRNA能否合适作为肿瘤标记物[]。如Li等[]在35例肺癌患者中，运用dPCR定量检测与肺癌相关的miRNAs(miR－31和miR－210)，其检测灵活度和特异性可分别抵达65.71%和85.00%。

二、dPCR：与下一代测序技术的融合在肿瘤检测中的应用

固然dPCR具有高灵活度和高精确性，但大多针对一些已知突变的检测。关于肿瘤未知基因变异的检测目前多运用下一代测序技术(Next generation sequencing，NGS)。NGS既可中止游离DNA的深度测序，深化描画肿瘤异质性，也可作为遗传易理性剖析的研讨措施。因而，dPCR的最新展开趋向是与NGS技术的融合。

(一)dPCR应用于文库剖析前的样质量控

关于包含NGS在内的许多基因剖析技术来说，DNA完好性/质量和浓度的评定一直是一个难题。Zonta等[]应用dPCR树立了一种多重剖析措施，即便微量的DNA上样量也可得到生物样本中的DNA分子信息。其原理是基于多重扩增位于不同基因组内的4种大小不同(片段大小呈递增趋向：78 bp、159 bp、197 bp和550 bp )的DNA片段，经过进一步定量各扩增子以评价DNA的质量。该措施适用于福尔马林固定石蜡包埋(formalin－fixed paraffin－embeded，FFPE)组织样本剖析，这些样本固然富含肿瘤DNA，但是DNA质量十分差，致使于NGS剖析常常只能得到劣质数据或失败的结果。这种措施减少了样本的运用，从而更有效和烦琐天时用可贵样本以取得牢靠的基因测序结果。

(二)dPCR在文库剖析中的应用

NGS文库生成后，在上测序仪前必须事前肯定浓度。有效的样本浓度定量，能够优化上样量从而俭省NGS剖析时间和成本。Genome Scan/Service XS最近推出了插入染料(EvaGreen)皮升微滴dPCR措施，来定量检测加载的文库浓度。NGS测序结果表明，与Agilent的生物剖析系统相比，运用微滴法来测定文库浓度效率更高。

(三)dPCR在NGS中的应用

dPCR已成为常规措施来考证NGS的测序结果，包含确认来源于少量DNA的低频突变。Alakus等[]运用皮升微滴dPCR来考证全外显子测序结果，他们经过这种措施检测阑尾来源的黏液性腹膜癌患者突变基因表白和拷贝数变异状况。同样的，运用测序与dPCR融合技术来剖析瘤内异质性也已在很多研讨中展开，如卵巢癌，乳腺癌以及结直肠癌等[,]。

靶向富集人类基因组特异性位点是大种群基因突变核酸序列研讨中一种极具应用前景的措施。在NGS应用中，微滴技术平台可大范围地平行富集出人类基因组的特异性位点。Tewhey等[]应用该措施，在微流体装置中运用一系列包含引物的皮升微滴微流体，与包含基因组DNA片段的微滴一对一融合，融合后的反响单元中止扩增得到含有特异性位点的文库用于后续的测序，仅运用50 μl模版即可同时中止250万次反响。其针对6例样天职别运用微滴化富集建库测序和传统PCR建库测序剖析了47个基因的435个外显子，发现前者能够取得高质量的研讨数据。简单的说，测序片段在靶率84%，基因测序掩盖度为90%，序列变异辨认精确度>99%，且样本间具有较高的重现度(r2＝0.9)。dPCR扩增子反响扩展至3 976个，总共取得1.49 Mb序列，且扩增后反响样天职别运用Illumina GAII和Roche 454平台同时测序，均取得了高特异性和高灵活性的剖析数据。这种商业化的序列富集法已被应用到多种肿瘤相关测序研讨中[]。

三、结论与瞻望

dPCR能够以高灵活度和精确度检测生物样本中的低频突变，而微流控工具所带来的微小化，促进了它的展开和提高。微滴和微室的运用已使体积的分割抵达皮升级别，小体积不只能够使单分子以高通量的方式高效扩增，还能节约样本和反响试剂，而且大大进步了灵活度。dPCR另一个重要特性就是能够精准完成靶向核酸的定量检测[]。dPCR是癌症研讨的理想工具，无论是用于发现癌症相关的基本问题还是癌症患者随访和治疗计划的选择。dPCR的高灵活性和高特异性使其能够在复杂的DNA混合物中检测到感兴味的稀有序列，因而该技术能够在血液、尿液或粪便等体液中检测循环肿瘤标记物，特别合适于癌症患者的微创或无创监测。最初dPCR是努力于检测目的序列在单体细胞中的突变，随着技术的展开，逐步触及其他肿瘤标记，如miRNA的表白异常和DNA甲基化水平的改动。

诚然定量PCR依旧是常见的基因剖析平台，而且研讨人员大多数能够熟练的操作；但是关于dPCR技术，操作人员需求做为新技术重新学习及熟习操作措施，以至是控制不同数据剖析方式。再者，从成本的比较上看，dPCR的成本比定量PCR高，速度及通量也不迭定量PCR。

dPCR应用于临床诊断的潜力是庞大的，估量未来这种技术会成为个体化医疗和精准医疗的必要工具，目的在于完成肿瘤的早期诊断和为患者选择最合适其遗传背景和肿瘤基因组的治疗计划。

(考文献：略）

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